本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)的基因突變檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門(mén)對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。
本指導(dǎo)原則是針對(duì)乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)的基因突變檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。
本指導(dǎo)原則是供申請(qǐng)人和審查人員使用的指導(dǎo)性文件，不涉及注冊(cè)審批等行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如有能夠滿(mǎn)足法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應(yīng)提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。
本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。
適用范圍
（一）臨床背景
乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染呈世界性流行，但不同地區(qū)HBV 感染的流行強(qiáng)度差異很大。全國(guó)2006年乙型肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查表明，我國(guó)1-59歲一般人群乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽(yáng)性率為7.18%，2014年中國(guó)疾病預(yù)防控制中心開(kāi)展的全國(guó)1—29歲人群乙型肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，1—4歲、5—14歲、15—29歲人群HBsAg陽(yáng)性率分別為0.32%、0.94%和4.38%，我國(guó)現(xiàn)有HBV感染者約有8000萬(wàn)。在臨床治療慢性乙型肝炎病毒感染的方案中，使用抗病毒藥物是最主要的手段?？?/span>HBV藥物主要包括干擾素α和核苷（酸）類(lèi)似物兩大類(lèi)，其中核苷（酸）類(lèi)藥物服用便捷，抗病毒效力強(qiáng)，不良反應(yīng)較小，但核苷（酸）類(lèi)藥物在抗HBV治療中需要長(zhǎng)期服藥，一旦出現(xiàn)病毒耐藥，可能導(dǎo)致治療失敗、病毒DNA反彈、肝功能惡化甚至肝衰竭。因此，如何發(fā)現(xiàn)病毒耐藥突變，進(jìn)而合理調(diào)整治療方案，在慢性乙型肝炎臨床治療中具有極其重要的意義。
HBV屬于嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），HBV基因組含有4個(gè)部分重疊的開(kāi)放讀框（ORF），即前-S/S區(qū)、前-C/C 區(qū)、P區(qū)和X區(qū)。其中P區(qū)編碼聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶，目前已知的核苷（酸）類(lèi)藥物的耐藥突變均發(fā)生在HBV的P區(qū)。HBV雖然屬于DNA病毒，但其復(fù)制需經(jīng)過(guò)以前基因組RNA為復(fù)制中間體的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在此過(guò)程中，HBV逆轉(zhuǎn)錄酶由于缺乏嚴(yán)格的校正機(jī)制，導(dǎo)致HBV復(fù)制過(guò)程中核苷酸錯(cuò)配率較高。HBV復(fù)制的這種過(guò)程和特點(diǎn)，導(dǎo)致同一患者體內(nèi)不同的HBV株基因序列之間也存在差異，因此，每一個(gè)患者體內(nèi)的病毒都是由不同基因序列的病毒株組成的動(dòng)態(tài)變化的病毒準(zhǔn)種，不同基因序列的病毒株在病毒準(zhǔn)種中所占的相對(duì)比例，一方面取決于病毒株自身的復(fù)制能力，另一方面也受到機(jī)體免疫系統(tǒng)或藥物的選擇壓力的影響。
抗病毒藥物核苷（酸）類(lèi)似物進(jìn)入機(jī)體后，形成三磷酸活性成分，與機(jī)體天然的脫氧三磷酸核苷（dNTP）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到HBV聚合酶上，使HBV的DNA鏈合成終止。如果患者體內(nèi)的HBV P區(qū)序列發(fā)生突變，導(dǎo)致產(chǎn)生的HBV聚合酶與核苷（酸）類(lèi)似物結(jié)合力降低，突變的HBV即不受核苷（酸）類(lèi)似物的抑制或抑制能力下降，在繼續(xù)應(yīng)用核苷（酸）類(lèi)似物治療的情況下，突變株病毒由于對(duì)核苷（酸）類(lèi)似物不敏感而逐漸成為優(yōu)勢(shì)株，從而導(dǎo)致患者對(duì)于核苷（酸）類(lèi)似物的耐藥。
乙型肝炎病毒的耐藥突變分為原發(fā)性耐藥突變和補(bǔ)償性耐藥突變，原發(fā)性耐藥突變指藥物作用靶位的基因及其編碼的氨基酸發(fā)生突變，導(dǎo)致突變病毒株對(duì)治療藥物的敏感性下降。雖然原發(fā)性耐藥突變株對(duì)藥物的抵抗性增加，但也常導(dǎo)致突變病毒本身的復(fù)制能力下降。補(bǔ)償性耐藥突變指由于原發(fā)性耐藥突變病毒株復(fù)制能力下降，在原發(fā)性耐藥突變的基礎(chǔ)上，病毒株在其它位點(diǎn)發(fā)生突變，這些突變可部分恢復(fù)突變病毒的復(fù)制能力或可導(dǎo)致突變病毒對(duì)藥物敏感性的進(jìn)一步下降。
目前經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于抗HBV治療的核苷（酸）類(lèi)似物有拉米夫定（LAM）、阿德福韋酯（ADV）、恩替卡韋（ETV）、替比夫定（LdT）、替諾福韋酯（TDF）和富馬酸丙酚替諾福韋（TAF）等。與拉米夫定常見(jiàn)耐藥相關(guān)的突變?yōu)?/span>rtM204I/V和rtL180M，其中rtM204V多與rtL180M聯(lián)合出現(xiàn)，rtM204I可單獨(dú)出現(xiàn)。與阿德福韋酯常見(jiàn)耐藥相關(guān)的突變?yōu)?/span>rtN236T與rtA181V/T，兩個(gè)位點(diǎn)可單獨(dú)或聯(lián)合出現(xiàn)。與恩替卡韋常見(jiàn)耐藥相關(guān)的突變是在rtM204V+rtL180M基礎(chǔ)上，再聯(lián)合rtT184、rtS202或rtM250三個(gè)位點(diǎn)中至少一個(gè)位點(diǎn)的氨基酸替代突變。與替比夫定常見(jiàn)耐藥相關(guān)的突變?yōu)?/span>rtM204I，其它位點(diǎn)如rtA181V/T等尚存在爭(zhēng)議。替諾福韋酯和富馬酸丙酚替諾福韋目前尚未發(fā)現(xiàn)確認(rèn)的耐藥突變。
HBV耐藥相關(guān)的檢測(cè)主要包括基因型耐藥檢測(cè)和體外表型分析等。
HBV基因型耐藥檢測(cè)是指采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)已在體外表型分析中被證實(shí)與抗病毒藥物耐藥相關(guān)的HBV突變的臨床檢測(cè)。目前已批準(zhǔn)產(chǎn)品采用的方法主要包括：PCR-測(cè)序法（direct PCR sequencing）、基因芯片法（gene chip）、PCR-反向雜交法（PCR-reverse hybridization assay）、實(shí)時(shí)熒光PCR法（real-time PCR）等。
HBV體外表型分析（in vitro phenotypic analysis）是公認(rèn)的確認(rèn)耐藥的檢測(cè)方法，通過(guò)體外復(fù)制系統(tǒng)證實(shí)檢測(cè)到的HBV突變會(huì)降低其對(duì)抗病毒藥物的敏感性，常用半數(shù)有效濃度（50% effective concentration，EC50）或半數(shù)抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）來(lái)評(píng)價(jià)耐藥程度的高低。其方法是將含有待檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)的HBV全基因組導(dǎo)入肝細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系，再將不同濃度梯度的核苷（酸）類(lèi)似物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，經(jīng)過(guò)一定培養(yǎng)時(shí)間后檢測(cè)藥物作用下HBV DNA的復(fù)制情況，計(jì)算EC50，通過(guò)與野生株病毒的EC50比較，判斷該突變對(duì)核苷（酸）類(lèi)似物的敏感性。當(dāng)抑制病毒復(fù)制所需的EC50與野生株相比增加l00倍以上稱(chēng)為高度耐藥、l0—99倍為中度耐藥、2—9倍為輕度耐藥。
（二）本指導(dǎo)原則適用范圍
本指導(dǎo)原則所述乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)的基因突變檢測(cè)試劑是指利用分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)人體血清/血漿樣本中乙型肝炎病毒耐藥突變位點(diǎn)進(jìn)行定性檢測(cè)的試劑。臨床適用人群為核苷（酸）類(lèi)似物治療過(guò)程中出現(xiàn)病毒學(xué)突破的患者。除非有明確證據(jù)表明初治患者感染HBV來(lái)自接受核苷（酸）類(lèi)似物抗病毒治療患者，一般不主張對(duì)初治患者進(jìn)行基因型耐藥檢測(cè)。
本指導(dǎo)原則是基于實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)產(chǎn)品相關(guān)申報(bào)資料提出要求，其他方法學(xué)的產(chǎn)品可依據(jù)產(chǎn)品特性確定其中具體內(nèi)容是否適用，如不適用，可另行選擇符合自身方法學(xué)特性的技術(shù)要求或評(píng)價(jià)方法。
本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行產(chǎn)品注冊(cè)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《辦法》）等相關(guān)法規(guī)要求。
詳細(xì)內(nèi)容，見(jiàn)https://www.cmde.org.cn/CL0112/20613.html